Блог

Jun 05, 2024

Микроскопия со структурированной подсветкой на просвет с перестраиваемой частотой освещения с использованием узла наклонного зеркала

Том 13 научных отчетов, номер статьи: 1453 (2023) Цитировать эту статью 2076 Доступов 4 Подробности об альтметрических метриках Мы представляем экспериментальную демонстрацию передачи с помощью наклонного зеркала.

Научные отчеты, том 13, Номер статьи: 1453 (2023) Цитировать эту статью

2076 Доступов

4 Альтметрика

Подробности о метриках

Мы представляем экспериментальную демонстрацию просвечивающей микроскопии со структурированным освещением (tSIM) с помощью наклонного зеркала, которая обеспечивает получение изображений со сверхвысоким разрешением в большом поле зрения. В качестве модуля освещения используется сборка специально разработанных наклонных зеркал, в которых образец возбуждается интерференцией двух лучей, отраженных от противоположной пары граней зеркала. Настраиваемые частотно-структурированные диаграммы генерируются путем изменения угла наклона зеркала, а гексагонально-симметричное расположение рассматривается для изотропного разрешения в трех ориентациях. Использование объектива с высокой числовой апертурой (NA) в стандартной SIM-карте обеспечивает сверхразрешение в компромиссе с полем зрения (FOV). Используя обнаружение объектива с низкой числовой апертурой (20X/0,4), мы экспериментально демонстрируем одно изображение размера \(\sim\) (0,56 мм\(\times\)0,35 мм) с \(\sim\)1,7- и \(\ sim\) Улучшение разрешения в 2,4 раза (использование различного освещения путем настройки наклонных зеркал) сверх дифракционного предела. Результаты проверяются как для флуоресцентных шариков, так и для биологических образцов. Геометрия tSIM разделяет пути освещения и сбора света, что позволяет свободно менять объектив визуализирующего изображения, не влияя на пространственную частоту диаграммы освещения, которая определяется наклонными зеркалами. Большой и масштабируемый угол обзора, поддерживаемый tSIM, найдет применение в приложениях, где необходимо сканирование больших площадей, например, при патологии, и в приложениях, где изображения должны быть коррелированы как в пространстве, так и во времени.

Преодоление дифракционного предела1,2 классической флуоресцентной микроскопии за последние два десятилетия произвело революцию в биомедицинских исследованиях и привело к появлению новой области исследований, названной «оптическая наноскопия»3,4. В быстро развивающейся области наноскопии микроскопия структурированного освещения (SIM)5,6,7 представляет собой важный метод широкопольного сверхразрешения, при котором для возбуждения флуоресцентного образца используется серия структурированных изображений, а соответствующие необработанные муаровые кадры вычислительно обрабатываются для получения добиться увеличения разрешения примерно в два раза по сравнению с пределом широкоугольного изображения. Несмотря на относительно умеренное повышение разрешения по сравнению с другими оптическими методами сверхразрешения, такими как истощение стимулированного излучения (STED),8,9 стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (STORM),10,11 фотоактивационная локализационная микроскопия (PALM), 12,13 или истощение основного состояния (GSD),14,15 SIM привлек значительное внимание благодаря своему высокому пространственно-временному разрешению, низкой фототоксичности, совместимости с общепринятыми флуоресцентными метками, эффективной многоцветной визуализации16,17 и так далее. Он также считается многообещающим подходом для исследования субклеточной динамики живых клеток18,19 из-за необходимости меньшего количества необработанных кадров и низкой дозы фотонов. Хотя синусоидальная структурированная диаграмма возбуждения является ключевой особенностью достижения изображений с превосходным разрешением с помощью SIM, она больше не ограничивается периодическими диаграммами освещения. Спеклообразное20,21 случайное освещение с подходами слепой реконструкции также успешно применяется для визуализации SIM. Однако методы случайного освещения обеспечивают сверхразрешение за счет низкого временного разрешения из-за требования большого количества кадров (\(\sim\)100 с). Эти методы стирают основную идею периодической визуализации со структурированным освещением, которая сводит к минимуму необходимое количество кадров 9 (15) в случаях 2D (3D) SIM, а в некоторых случаях, о которых недавно сообщалось, даже меньше22,23. Следовательно, усилия по дальнейшему улучшению разрешения SIM за счет поддержания четко определенных периодических шаблонов освещения являются целесообразными.

В традиционном методе линейной SIM используется одна линза объектива для освещения образца, а также для сбора сигнала флуоресценции. Следовательно, и освещение, и оптика обнаружения дифракционно ограничены одной и той же линзой объектива, и система строго ограничена возможностью двукратного улучшения разрешения по сравнению с классическим дифракционным пределом. Чтобы еще больше превзойти типичный предел разрешения SIM, существует флуоресцентный метод полного внутреннего отражения (TIRF)-SIM24,25, в котором высокочастотная интерференционная картина затухающих волн освещает образец. Однако освещение TIRF ограничено тонким оптическим сечением (<100 нм) и, следовательно, применимо только к 2D-изображениям. Кроме того, свойства насыщения флуоресцентных материалов используются в нелинейном подходе SIM26,27,28, который включает вклад нескольких гармоник в визуализацию сверхвысокого разрешения. Однако требование высокой интенсивности для достижения рабочего уровня насыщения флуорофоров может создать проблемы фототоксичности для нелинейного подхода. Сообщалось также о других методах SIM, основанных на других принципах, например, плазмонном29,30, бесконтактной проекционной решетке31 или фотонном чипе32. Каждый из этих методов требует сложных и специализированных фотонных или плазмонных материалов для управления структурированной картиной освещения в плоскости образца. Кроме того, для фазового сдвига и изменения ориентации структуры требуются специально разработанные инструменты, например, термооптика для фотонных чипов SIM или гальвосканирование для плазмонных SIM. В целом эти методы сложны из-за их зависимости от посвященного материала; что ограничивает возможность настройки частоты диаграммы направленности освещения. В плазмонной SIM предварительно калиброванные матричные структуры изготавливаются в соответствии с рабочим диапазоном длин волн. Конкретная структура избирательно определяет ориентацию и частоту рисунка освещения, возможность настройки рисунка отсутствует. Аналогично, в SIM фотонного чипа частота диаграммы направленности заранее определяется углами доступных плеч волновода. Наконец, обычные образцы на предметных или покровных стеклах микроскопа не подходят для этих методов. Необходимо подготовить образец на поверхности проектируемого материала, которая освещается интерференционной картиной стоячих волн в затухающем режиме, ограничивая эти методы сверхразрешением 2D-TIRF.