Блог

Jun 28, 2023

Сравнение альтернативных технологий очистки вирусных векторов

Джек Викальви, главный научный сотрудник J2 Biopharm Associates LLC. Это обзор избранных инновационных продуктов и подходов, разработанных за последние 15 лет, которые способствовали

Джек Викальви, главный научный сотрудник J2 Biopharm Associates LLC

Это обзор избранных инновационных продуктов и подходов, разработанных за последние 15 лет, которые способствовали усовершенствованиям, позволяющим производить терапевтические средства на основе вирусных векторов с более высокой степенью извлечения и чистоты.

Это вторая часть серии, посвященной некоторым конкретным достижениям в области технологий очистки. В первой части обсуждалось последующее оборудование и процессы получения моноклональных антител.

Во второй части мы рассмотрим, как эти продукты могут изменить способ производства таких терапевтических средств на основе вирусных векторов, где их можно использовать в текущих схемах разработки процессов и какие преимущества они дают по сравнению с предыдущими методами. Мы затрагиваем ситуационную экономику, которая стимулирует использование этих инновационных продуктов или подходов. Наконец, мы сосредоточимся на моделях масштабирования GMP для практических целей: если они не масштабируются по GMP, не имеет значения, насколько хорошо они работают в разработке.

Блок-схемы процессов вирусных векторов

Осветление урожая вирусных векторов более сложное, чем осветление моноклональных антител. Традиционное осветление обычно начинается с дифференциального или градиентного центрифугирования. В лучшем случае это может быть проблематично для производства GMP в масштабах более 100 л, поскольку размер загрузки партии ведра центрифуги обычно невелик (от 10 до 20 л); кроме того, существуют проблемы, связанные с образованием аэрозолей, очисткой и проверкой, а также затраты на капитальное оборудование, которые могут стать препятствием. Даже при использовании этапа центрифугирования остается необходимость глубинной и стерильной фильтрации. Использование заряженных глубинных фильтров может оказаться нецелесообразным в зависимости от вируса, поскольку большинство вирусов связываются фрагментами с анионным зарядом. Однако в присутствии 200–300 мМ NaCl многие вирусы не удаляются такими устройствами, тогда как часть ДНК HCP и клетки-хозяина все еще остается связанной.

Вирусы с оболочкой, такие как лентивирусы и альфавирусы, более лабильны и могут плохо справляться с глубинной фильтрацией. Однако альфавирусы более устойчивы и могут поддаваться обычной и даже усиленной глубинной фильтрации. В этих случаях мы последовательно используем Pall SupraCap 100 (от 4 до 2,1 мкм), Pall HCDII (1,2 мкм) и AcroPak 500 (от 0,8 до 0,45 мкм). Также можно использовать мембраны Millipore DOHC, COHC и XOHC. Использование фильтров с размером пор 0,2 мкм обычно приводит к значительным потерям, и его следует избегать до окончательной фильтрации. Поддержание асептической закрытой системы во время обработки является обязательным.

Более популярные вирусы без оболочки, такие как аденовирусы (АВ) и аденоассоциированные вирусы (ААВ), можно осветлить с помощью заряженных глубинных фильтров 3М в присутствии 180–250 мМ NaCl. Мы последовательно используем фильтры 05SP (от 10 до 2 мкм) и 60SP (от 3 до 0,2 мкм) для безоболочковых и некоторых оболочечных альфавирусов.

Традиционным методом захвата вирусных векторов является AIEX. Это может быть достигнуто с использованием смол или мембран. Для вирусов с оболочкой обычно лучше всего подходит мембранный подход, поскольку он гораздо щадит вирус, чем мучительный путь через насадочную колонку. Наиболее распространенные устройства включают Pall Mustang Q, Sartorius Sartobind Q-STIC и монолит BIA CIMultus. Самым большим недостатком мембран или монолитов является их низкая производительность, что приводит к необходимости использования нескольких циклов. Однако использование колонки с небольшой высотой слоя (от 6 до 10 см) также может работать, с дополнительным преимуществом значительного увеличения производительности по сравнению с мембранами. Обычно используемые вирусы без оболочки можно улавливать либо смоляными, либо мембранными устройствами.

Альтернативный метод — использование аффинной хроматографии. Многие вирусы имеют на своей поверхности участки связывания гепарина, в том числе вирусы с оболочкой. Мы добились успеха с гепарином HyperD в качестве этапа захвата альфавируса после расщепления нуклеазой M-SAN и осветления, что привело к извлечению> 90% с отличным удалением hcDNA и значительным снижением HCP при работе колонки со скоростью 450 см/час. Керамические смолы HyperD по эксплуатационным характеристикам аналогичны полистирольным смолам. Существуют и другие протоколы очистки, которые включают сульфат целлюфина или капто-деВирС в качестве начального этапа улавливания; эти смолы хорошо зарекомендовали себя при очистке флавивирусов.